乙肝病毒测序的意义

　　我国是病毒性肝炎的高发区。10年前乙肝的诊断主要依靠二对半检测，如今，HBV DNA定量检测是乙肝患者的最重要的指标之一，随着人类基因组计划的完成和后基因组时代的到来， 分子生物学技术的迅猛发展给检验医学的进步指明了新的方向。基因分析方法正在成为一种新的检测手段，服务于疾病的临床治疗和控制。

　　认识事物要从质和量双方面入手，诊断治疗乙肝单纯知道乙肝病毒的量是不够的，还需要通过测序来认识乙肝病毒的DNA序列特征。为何有的病毒性肝炎很稳定，有的一直反复?为何有的患者很快就发生肝硬化、肝癌?拉米夫定反跳而乙肝病毒并无YMDD变异该如何解释?等等问题是无法用二对半和DNA定量等方法来解释的，因为以上的方法检测不到病毒的本质。临床很需要全面认识病毒本身──DNA序列。运用基因直接测序方法对当地流行的乙肝病毒毒株的基因特点和变异特性进行分析，才能对乙肝的预防、治疗有所裨益。对HBV变异的判断，最可靠和精确的方法是从患者体内检出HBV—DNA，用DNA测序法来确定病毒的变异。对于HBV变异的研究比较集中在于前C区及S基因区的变异。

　　HBV在发生变异后，可能会出现以下的变化和后果：

　　1.对人体的致病性发生改变

　　HBV感染后临床上可产生不同的肝脏疾病谱。以往认为主要是与宿主的不同免疫应答有关，近来的研究发现这种临床变化与病毒本身密切相关。前C区基因的变异包括启动子的丢失、终止密码的产生、信号肽裂解部位附近核苷酸的错义变异、以及缺失和插入变异导致读码框移动等都可产生HBeAg合成和分泌的障碍，但不影响病毒的复制。其中研究较多的是前C区密码28终止变异(nt1896G→A)，HBsAg、抗-HBe及HBV DNA均持续阳性而HBeAg阴性的患者在前C区末端出现在1896、1899 nt (均由A替代G)和1909 nt (由T替代C)的点突变，并在1896nt处使原来编码色氨酸的前C区第28个密码子(TGG)转变为翻译终止密码子(ATG)，因而前C蛋白的翻译中断，HBeAg不能产生。目前，一般将这种突变称为A1896型。其结果可能使乙型肝炎病情迁延、容易发生慢性肝炎、甚至肝硬化。

　　2.对乙型肝炎诊断的影响

　　由于乙肝病毒发生变异，可能影响乙型肝炎的特异性诊断。如：HBV前C区基因发生变异，使HBeAg不能产生，lin检查HBeAg会产生阴性结果，这种HBeAg阴性并不反映HBV复制减轻和消失，而仍有HBV前C区变异病毒的存在和复制。重叠于X基因的BCP区，调控HBV前C基因组mRNA转录和HBV前基因组mRNA转录。BCP区nt1762碱基由A→T和1764碱基由G→A变异(T1762A1764)，可能是另一类HBV感染后HBeAg缺失的原因。又如HBV S区基因发生变异，S基因密码子第122和123位之间“a”决定簇前插入2个氨基酸或S基因密码子，第123和124位之间多编码了3个氨基酸，此种变异导致HBsAg抗原性发生改变，常规酶联免疫方法所用的抗—HBS不能与变异的HBsAg结合，导致HBsAg(—)HBV感染。除了插入变异外，S基因的多处变异均可影响HBsAg的抗原性，导致HBsAg(—)HBV感染。由于S基因变异导致隐匿性HBV感染，对性传播和输血传播有重要意义。

　　3.对治疗的影响

　　(1)干扰素治疗对HBV的压力主要集中在前C/C区及前S区，近来对前C区基因变异的研究显示干扰素治疗并不增加前C区基因变异的机会，前C区终止变异并不影响干扰素治疗应答，但在干扰素治疗过程中产生前C区变异往往可预示病毒清除失败。感染前C1896变异毒株者对干扰素应答提高可能是间接的，因为感染前C1896变异毒株者往往ALT较高，而ALT升高是预测对干扰素应答好的指标之一。感染前C1896变异毒株的患者仍对干扰素敏感。故临床应用干扰素治疗越早越好。

　　(2)核苷类似物的治疗压力集中在多聚酶的活性区，拉米呋啶治疗患者最常见的是HBV P基因G743C和/或G743A的YMDD变异，M552V亦可与YMDD上游23个氨基酸处形成的L528M(在528位上亮氨酸被蛋氨酸取代)合并存在。泛昔洛韦治疗患者常见变异位于氨基酸第518-530位。

　　(3)HBV前C变异毒株的感染是导致肝移植后肝功能衰竭的重要原因。

　　4.对预防的影响

　　(1)乙肝疫苗是目前预防乙型肝炎病毒感染的最有效的特异性预防措施。但在HBV-S区基因发生变异时，目前应用的乙肝疫苗就不能预防这种HBV变异株感染，导致免疫失败。当前对HBV感染者母亲所生婴儿主张用特异性高价免疫球蛋白及乙肝疫苗(HBIG/HBsAg)被动加主动免疫，但仍会有2-3%的婴儿出现HBV感染，序列分析证明，这种感染主要是突变株引起，可以逃避免疫攻击，这种突变株主要是sG145R变异株(精氨酸取代甘氨酸，国际上习惯称为sR145)。

　　(2)当肝病终末期患者进行肝移植，并用人类抗-HBs或高效价乙肝免疫球蛋白治疗以防止移植物再次感染时，有些病例HBsAg仍为阳性。主要能形成sR145突变株已逐渐得到公认，其次是S基因第20、44、114、130、145、184和188位氨基酸等多处变异。

　　5.HBV基因型与临床关系

　　HBV DNA聚合酶缺乏校对酶的作用，因此HBV复制中容易发生核苷酸配对错误，这种原型病毒间的DNA序列差异称之为自然异质性，表现为不同的HBV基因型。目前规定HBV DNA核苷酸序列差异≥8%为一种基因型，而同一基因型的HBV DNA核苷酸序列差异≤5.6%，因而HBV分为A-H 8种基因型。随着HBV基因分型的广泛开展，新的基因型、基因亚型会逐渐被发现，基因分型方法逐渐简单、准确、便于应用，基因与临床关系日趋明朗。

　　(1)与病毒变异的关系： 前C区1896变异是基因型依赖的，在B、C、D和E型的G1896与T1858配对的干襻结构不稳定，1896的G—A变异使干襻结构趋于稳定，故前C区终止码变异率较高。而A和F型的1858位核苷酸为C，能与1896位核苷酸C形成稳定的结构，较少发生变异。所以，前C区1896变异的流行率与基因型相关，这就造成HBeAg阴性HBV感染流行率与地区优势基因型相关的现象。C基因启动子(CP区)变异也与基因型相关。1858位核苷酸为C的基因型(A、F基因型)较1858位核苷酸为T的基因型(B、C、D、E基因型)更易出现CP区变异。C基因型中CP区A1762T、G1764A双突变发生率显著高于B基因型。

　　(2)与临床结局的关系：由于病毒的基因控制着抗原的表达，不同的毒株出现某些变异的频率不同，不同毒株对机体免疫清除抵抗力不同以及其它的因素也可能导致了不同的基因型具有不同的感染后疾病谱。从目前的研究来看，HBV-C基因型与较重的肝脏病变相关，B型则与较轻的病变相关;A型与慢性肝炎相关，D型与急性自限型肝炎相关。此外，在与肝癌的关系中，C基因型与50岁以上的肝癌相关，而B基因型则与年轻的肝癌相关。

　　(3)与临床治疗的关系：HBV基因型A对标准干扰素治疗应答率较其它基因型高，这与不同基因型的分子病毒学特点有关。感染不同基因型的HBV患者接受干扰素治疗的合理疗程也应不同。

　　基因突变位点的检测可以用酶切法、变性梯度凝胶电泳法、变性高压液相电泳法等多种方法，但这些方法费时，繁琐，而且检测到的突变最后还都得通过测序来确定突变的类型及突变的位置，DNA测序是最直接检测基因变异的方法。通过测序发现新的突变位点，在分子水平揭示耐药性的机制，及时监测病毒的变异情况对临床指导用药意义重大，可使临床研究提高到一个新的分子水平。

　　目前发现的HBV基因型有8种，分别被命名为A到H型，各型HBV全基因核苷酸的差异在8%以上。HBV基因型之间存在着致病和治疗应答方面的差异。例如，C型HBV患者的病情通常比B型更重一些，D型HBV患者的病情通常比A型更重一些。C/D混合型感染HBV患者比B/C混合型感染对干扰素治疗的应答率低。目前已发现B型和C型、A型和D型均可发生两种基因型的重组，从而使HBV的基因型呈现多样化。